Płytki krwi a przerzuty nowotworowe – nowe spojrzenie na antagonistów P2Y12

Czy interakcje między płytek krwi a komórkami nowotworowymi determinują przerzuty?

Związek między nowotworem a zakrzepicą znany jest medycynie od prawie półtora wieku i często określany jako zespół Trousseau. Choć płytki krwi tradycyjnie postrzegane są jako kluczowe elementy hemostazy i zakrzepicy, coraz więcej dowodów wskazuje na ich złożone interakcje z komórkami nowotworowymi, które odgrywają istotną rolę w kluczowych etapach przerzutowania nowotworów. Płytki krwi promują inwazyjność komórek nowotworowych m.in. poprzez stymulację produkcji metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej-2, co ma szczególne znaczenie w przypadku raka prostaty i innych typów nowotworów złośliwych.

Receptory błonowe płytek krwi odgrywają kluczową rolę w procesie przylegania, agregacji i aktywacji płytek. Do najważniejszych należy integrina αIIbβ3, niezbędna do pełnego przylegania i agregacji płytek. Ponadto czynnik krzepnięcia IIa (trombina) indukuje aktywację płytek poprzez receptory aktywowane przez proteazy (PAR-1 i PAR-4). Adenozynodifosforan (ADP), zawarty w gęstych ziarnistościach płytek, jest induktorem wtórnej agregacji płytek. Główne receptory ADP, P2Y1 i P2Y12, uczestniczą w agregacji płytek, przy czym P2Y12 odgrywa kluczową rolę w wydzielaniu z gęstych ziarnistości, aktywacji receptora fibrynogenu i tworzeniu skrzepu. Co istotne, w praktyce klinicznej zastosowanie znajdują jedynie antagoniści receptora P2Y12.

Komórki nowotworowe mogą aktywować płytki krwi zarówno przez bezpośredni kontakt, jak i poprzez uwalnianie mediatorów takich jak ADP, trombina, tromboksan A2 czy proteazy cysteinowe związane z guzem. Wcześniejsze badania wykazały, że selektywny agonista receptora P2Y1 (2-methylthioadenosine-5-diphosphate) powodował zmniejszenie wzrostu komórek czerniaka A357 in vitro, podczas gdy agonista receptora P2Y2 (trójfosforan urydyny) powodował wzrost tych komórek. Nie było jednak jasne, czy antagonista receptora P2Y12 również odgrywa rolę w procesie przerzutowania komórek nowotworowych. “Interakcje między płytkami krwi a komórkami nowotworowymi są kluczowe dla wielu procesów związanych z progresją nowotworu, w tym dla tworzenia przerzutów” – podkreślają autorzy badania.

Czy antagonista P2Y12 to klucz do zahamowania przerzutów?

Klopidogrel, antagonista receptora P2Y12, jest szeroko stosowany w leczeniu chorób tętnic wieńcowych, naczyń obwodowych i chorób naczyniowo-mózgowych. Czy jednak może znaleźć zastosowanie w hamowaniu przerzutów nowotworowych? Naukowcy wykorzystali komórki czerniaka mysiego B16-BL6 jako model przerzutowania, aby zbadać bezpieczeństwo blokowania receptora P2Y12 i wyjaśnić wpływ klopidogrelu na proces tworzenia przerzutów.

W badaniu wykorzystano linię komórkową czerniaka mysiego B16-BL6, która charakteryzuje się wysokim potencjałem przerzutowym. Linia ta wywodzi się z linii B16-F0, która powstała z naturalnie występującego czerniaka skóry (ucha) myszy C57BL/6J. Linia B16-F1 została wyprowadzona z kolonii przerzutów płucnych wytworzonych przez podanie komórek B16-F0 do żyły ogonowej myszy syngenicznej C57BL/6J. Linia B16-F10 została następnie wielokrotnie wyselekcjonowana przez 10 kolejnych pasaży zmian przerzutowych w płucach. Następnie komórki B16-F10 podawano do pęcherzy moczowych samców myszy C57BL/6J przez nasieniowód, a pęcherze podwiązywano, wycinano i utrzymywano na półstałym agarze. Komórki, które migrowały przez ścianę pęcherza, odzyskiwano z agaru, hodowano aseptycznie i poddawano ponownemu pasażowi. Proces ten powtarzano sześciokrotnie, a powstałą linię komórkową nazwano B16-BL6. Według wcześniejszych badań potencjał przerzutowy tych linii można uszeregować następująco: B16-F0 < B16-F1 < B16-F10 = B16-BL6.

W badaniu zastosowano model eksperymentalny opracowany przez grupę Fidlera. Komórki czerniaka B16-BL6 (1×10⁵ komórek) wstrzykiwano do żyły ogonowej myszy szczepu C57BL/6N. Na 6 godzin przed iniekcją i codziennie po niej, myszy otrzymywały doustnie klopidogrel w dawkach 0, 5 lub 25 mg/kg (rozpuszczony w 0,9% roztworze NaCl). Zastosowane dawki były nieco wyższe niż stosowane klinicznie (1,5 mg/kg). Dwa tygodnie po iniekcji komórek nowotworowych myszy uśmiercano, a płuca pobierano i utrwalano w zbuforowanym roztworze formaldehydu. Guzki nowotworowe liczono przy użyciu szkła powiększającego. Równolegle przeprowadzono badanie wpływu klopidogrelu na hemostazę z wykorzystaniem modelu ekscyzji końcówki ogona.

Model ekscyzji końcówki ogona został zaadaptowany z wcześniejszych prac. W skrócie, siedem myszy na grupę znieczulano pentobarbitalem, a dolny segment ogona przecierano 70% etanolem i pozostawiano do wyschnięcia na powietrzu. Punkt ekscyzji końcówki ogona zaznaczano na 1 mm od dystalnego końca. Sterylnych ostrzy żyletkowych używano do odcięcia końcówki ogona jednym szybkim ruchem tnącym. Końcówkę ogona trzymano 1,5 cm nad powierzchnią gazy. Krążki bibuły filtracyjnej (o średnicy 5 mm) wykonane z bibuły Whatman nr 4 przykładano do krwawiącej końcówki ogona, ale nie pozwalano im dotykać ogona, a krew zbierano w 15-sekundowych odstępach, aż krążki nie były już nasączone krwią. Krążki nasączone krwią wrzucano do plastikowych probówek zawierających 2 ml 10% NaOH w odstępach 1-minutowych przez 10 kolejnych minut lub do momentu osiągnięcia hemostazy. Oznaczano hemoglobinę i szacowano utratę krwi przez zliczenie wszystkich probówek zbiorczych od każdej myszy.

Jakie lekcje niosą ze sobą wyniki badań nad antagonistami P2Y12?

Wyniki badania wykazały, że wysoka dawka klopidogrelu (25 mg/kg) słabo, ale istotnie hamowała przerzuty do płuc. Jednocześnie podawanie klopidogrelu przez 2 tygodnie powodowało zależny od dawki wzrost utraty krwi w modelu ekscyzji końcówki ogona. Niskie (5 mg/kg) i wysokie (25 mg/kg) dawki klopidogrelu zwiększały całkowitą utratę krwi odpowiednio około 10- i 16-krotnie w porównaniu z grupą kontrolną. Czas do osiągnięcia hemostazy w obu grupach klopidogrelu przekraczał 10 minut od urazu. Mimo zwiększonej utraty krwi, nie zaobserwowano wpływu na masę ciała myszy leczonych klopidogrelem. Czy zatem potencjalne korzyści antymetastatyczne przewyższają ryzyko zwiększonego krwawienia?

Efekt antymetastatyczny klopidogrelu w prezentowanym modelu przerzutów hematogennych wydaje się stosunkowo słaby, ponieważ wskaźnik przerzutów w grupie otrzymującej wysoką dawkę (25 mg/kg) był tylko o 24,3% niższy w porównaniu z grupą kontrolną. “Biorąc pod uwagę trombocytozę u pacjentów z nowotworem i przeciwzakrzepowe działanie klopidogrelu, przydatne mogą być inne modele przerzutów hematogennych” – sugerują badacze. Na przykład, jednoczesne wstrzyknięcie myszom ADP i komórek nowotworowych mogłoby przyspieszyć przerzutowanie komórek nowotworowych.

Czy integracja terapii przeciwnowotworowej z modulacją immunologiczną jest przyszłością?

Warto zestawić te wyniki z innymi badaniami nad antagonistami receptora P2Y12. Gareau i współpracownicy wykazali, że tikagrelor, inny antagonista receptora P2Y12, hamował interakcje płytek krwi z komórkami nowotworowymi i przerzuty ludzkich i mysich komórek raka piersi. Co więcej, tikagrelor, ale nie klopidogrel, zmniejszał przerzuty i poprawiał przeżywalność w ortotopowym modelu mysiego raka piersi 4T1. Z drugiej strony, Palacios-Acedo i współpracownicy stwierdzili, że klopidogrel dawał lepsze wskaźniki przeżycia z mniejszymi guzami pierwotnymi i mniejszą liczbą przerzutów niż aspiryna (inhibitor cyklooksygenazy) i był bardziej skuteczny w rozpuszczaniu spontanicznych endogennych skrzeplin w ortotopowym mysim modelu raka trzustki.

Najnowsze badania Jantscha i współpracowników nad wpływem dwusiarczanu klopidogrelu na komórki czerniaka mysiego B16-F10 i rozwój guza w mysim modelu czerniaka wykazały, że dwusiarczan klopidogrelu zmniejszał żywotność komórek i proliferację komórek B16-F10 in vitro oraz zmniejszał liczbę guzków in vivo. Jakie są różnice metodologiczne między tymi badaniami? W omawianym badaniu wstrzykiwano komórki czerniaka mysiego B16-BL6 do żyły ogonowej myszy, podczas gdy Jantsch i współpracownicy podawali komórki czerniaka mysiego B16-F10 myszom dootrzewnowo. Innymi słowy, prezentowane badanie oceniało działanie antymetastatyczne klopidogrelu, natomiast Jantsch i współpracownicy badali działanie przeciwnowotworowe dwusiarczanu klopidogrelu. Co więcej, zarówno Palacios-Acedo i współpracownicy, Jantsch i współpracownicy, jak i autorzy omawianego badania podawali klopidogrel myszom doustnie, ponieważ klopidogrel jest prolekiem, który jest metabolizowany do aktywnej formy przez CYP2C19, enzym wątrobowy.

Biorąc pod uwagę, że płytki krwi chronią guzy przed komórkami NK (Natural Killer) i cytotoksycznością TNFα, konieczne może być zbadanie wpływu klopidogrelu na aktywność komórek NK u myszy z wszczepionymi komórkami B16-BL6. Czy potencjalne zastosowanie klopidogrelu w terapii przeciwnowotworowej powinno uwzględniać jednoczesną modulację odpowiedzi immunologicznej?

Podsumowując, chociaż konieczne jest uwzględnienie zwiększonego krwawienia jako działania niepożądanego, klopidogrel może być obiecującym kandydatem jako aktywny lek antymetastatyczny. “Nasze badanie wskazuje na potencjał terapeutyczny antagonistów receptora P2Y12 w kontekście hamowania przerzutów nowotworowych, jednak wymaga to starannego zbilansowania korzyści i ryzyka w warunkach klinicznych” – konkludują badacze. Czy zatem warto rozważyć włączenie antagonistów receptora P2Y12 do protokołów leczenia onkologicznego u pacjentów z wysokim ryzykiem przerzutów?

Podsumowanie

Badania wykazują istotną rolę interakcji między płytkami krwi a komórkami nowotworowymi w procesie przerzutowania. Kluczową rolę odgrywają receptory błonowe płytek krwi, w tym integrina αIIbβ3 oraz receptory P2Y1 i P2Y12. Klopidogrel, antagonista receptora P2Y12, w wysokiej dawce 25 mg/kg wykazał zdolność do hamowania przerzutów do płuc w modelu eksperymentalnym z wykorzystaniem komórek czerniaka mysiego B16-BL6. Jednakże efekt ten był stosunkowo słaby, z redukcją wskaźnika przerzutów o 24,3% w porównaniu z grupą kontrolną. Jednocześnie zaobserwowano istotne działanie niepożądane w postaci zwiększonego krwawienia. Inne badania z wykorzystaniem tikagreloru i różnych modeli nowotworowych pokazują zróżnicowane wyniki, sugerując potrzebę dalszych badań nad potencjalnym wykorzystaniem antagonistów P2Y12 w terapii przeciwnowotworowej, szczególnie w kontekście modulacji odpowiedzi immunologicznej.